पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन जीन को बढ़ाने के लिए कैसे काम करता है

पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) एक जीन की कई प्रतियां बनाने के लिए एक आणविक आनुवंशिक तकनीक है और यह जीन अनुक्रमण प्रक्रिया का भी हिस्सा है।

डीएनए के नमूने का उपयोग करके जीन की प्रतियां बनाई जाती हैं, और नमूने में पाए गए जीन की एक प्रति से कई प्रतियां बनाने के लिए तकनीक काफी अच्छी है। लाखों प्रतियां बनाने के लिए एक जीन का पीसीआर प्रवर्धन, डीएनए के टुकड़े के आकार और चार्ज (+ या -) के आधार पर दृश्य तकनीकों का उपयोग करके जीन अनुक्रमों की पहचान और पहचान की अनुमति देता है।

नियंत्रित परिस्थितियों में, डीएनए के छोटे खंड डीएनए पोलीमरेज़ नामक एंजाइम द्वारा उत्पन्न होते हैं, जो पूरक डीऑक्सीन्यूक्लियोटाइड जोड़ते हैं (dNTPs) डीएनए के एक टुकड़े को "टेम्पलेट" के रूप में जाना जाता है। डीएनए के छोटे टुकड़े, जिन्हें "प्राइमर्स" कहा जाता है, का उपयोग के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में किया जाता है पोलीमरेज़

प्राइमर डीएनए (ऑलिगोमर्स) के छोटे मानव निर्मित टुकड़े होते हैं, आमतौर पर 15 से 30 न्यूक्लियोटाइड के बीच लंबे होते हैं। वे प्रवर्धित होने वाले जीन के बहुत सिरों पर छोटे डीएनए अनुक्रमों को जानकर या अनुमान लगाकर बनाए जाते हैं। पीसीआर के दौरान, अनुक्रमित किए जा रहे डीएनए को गर्म किया जाता है और डबल स्ट्रैंड अलग हो जाते हैं। ठंडा होने पर, प्राइमर टेम्प्लेट (एनीलिंग कहा जाता है) से जुड़ जाते हैं और पोलीमरेज़ के शुरू होने के लिए जगह बनाते हैं।

पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) थर्मोफाइल और थर्मोफिलिक की खोज से संभव हुआ पोलीमरेज़ एंजाइम (एंजाइम जो उच्च तापमान पर गर्म होने के बाद संरचनात्मक अखंडता और कार्यक्षमता बनाए रखते हैं) तापमान)। पीसीआर तकनीक में शामिल कदम इस प्रकार हैं:

• डीएनए टेम्प्लेट, पोलीमरेज़ एंजाइम, प्राइमर और dNTPs के अनुकूलित सांद्रता के साथ एक मिश्रण बनाया जाता है। गर्म करने की क्षमता एंजाइम को विकृत किए बिना मिश्रण 94 डिग्री की सीमा में तापमान पर डीएनए नमूने के दोहरे हेलिक्स को विकृत करने की अनुमति देता है सेल्सियस।
• विकृतीकरण के बाद, नमूना को अधिक मध्यम श्रेणी में ठंडा किया जाता है, लगभग 54 डिग्री, जो प्राइमरों को एकल-फंसे डीएनए टेम्पलेट्स के लिए एनीलिंग (बाइंडिंग) की सुविधा प्रदान करता है।
• चक्र के तीसरे चरण में, नमूना को 72 डिग्री तक गर्म किया जाता है, टाक डीएनए पोलीमरेज़ के लिए आदर्श तापमान, बढ़ाव के लिए। बढ़ाव के दौरान, डीएनए पोलीमरेज़ पूरक dNTPs को जोड़ने के लिए एक टेम्पलेट के रूप में डीएनए के मूल एकल स्ट्रैंड का उपयोग करता है प्रत्येक प्राइमर के 3' सिरों तक और रुचि के जीन के क्षेत्र में डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए का एक खंड उत्पन्न करें।
• प्राइमरों ने डीएनए अनुक्रमों की घोषणा की है जो सटीक मिलान नहीं हैं, 72 डिग्री पर annealed नहीं रहते हैं, इस प्रकार ब्याज की जीन को बढ़ाव सीमित करते हैं।

विकृतीकरण, एनीलिंग और बढ़ाव की यह प्रक्रिया कई (30-40) बार दोहराई जाती है, जिससे मिश्रण में वांछित जीन की प्रतियों की संख्या में तेजी से वृद्धि होती है। यद्यपि यह प्रक्रिया काफी थकाऊ होगी यदि मैन्युअल रूप से की जाती है, तो नमूने तैयार किए जा सकते हैं और एक में ऊष्मायन किया जा सकता है प्रोग्राम करने योग्य थर्मोसायकलर, जो अब अधिकांश आणविक प्रयोगशालाओं में आम है, और एक पूर्ण पीसीआर प्रतिक्रिया में किया जा सकता है 3-4 घंटे।

प्रत्येक विकृतीकरण चरण पिछले चक्र की बढ़ाव प्रक्रिया को रोकता है, इस प्रकार डीएनए के नए स्ट्रैंड को काटता है और इसे वांछित जीन के आकार में रखता है। बढ़ाव चक्र की अवधि को रुचि के जीन के आकार के आधार पर लंबा या छोटा बनाया जा सकता है, लेकिन अंततः, बार-बार चक्रों के माध्यम से पीसीआर, अधिकांश टेम्प्लेट केवल रुचि के जीन के आकार तक ही सीमित रहेंगे, क्योंकि वे दोनों के उत्पादों से उत्पन्न हुए होंगे। प्राइमर।

कई अलग हैं सफल पीसीआर के लिए कारक जो परिणामों को बढ़ाने के लिए हेरफेर किया जा सकता है। पीसीआर उत्पाद की उपस्थिति के परीक्षण के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल की जाने वाली विधि है agarose जेल वैद्युतकणसंचलन. जिसका उपयोग आकार और आवेश के आधार पर डीएनए के टुकड़ों को अलग करने के लिए किया जाता है। फिर रंगों या रेडियोआइसोटोप का उपयोग करके टुकड़ों की कल्पना की जाती है।

पीसीआर की खोज के बाद से, मूल टाक के अलावा अन्य डीएनए पोलीमरेज़ की खोज की गई है। इनमें से कुछ में बेहतर "प्रूफरीडिंग" क्षमता होती है या उच्च तापमान पर अधिक स्थिर होती है, इस प्रकार पीसीआर की विशिष्टता में सुधार होता है और गलत डीएनटीपी के सम्मिलन से त्रुटियों को कम करता है।

पीसीआर के कुछ रूपों को विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए डिज़ाइन किया गया है और अब आणविक आनुवंशिक प्रयोगशालाओं में नियमित रूप से उपयोग किया जाता है। इनमें से कुछ रीयल-टाइम पीसीआर और रिवर्स-ट्रांसक्रिपटेस पीसीआर हैं। पीसीआर की खोज से डीएनए अनुक्रमण का विकास भी हुआ है। डी ऑक्सी राइबो न्यूक्लिक एसिड अंगुली का निशान और अन्य आणविक तकनीक।