डीएनए अनुक्रमण के लिए तकनीक

का क्षेत्र जैव प्रौद्योगिकी निरंतर परिवर्तन में से एक है। अत्याधुनिक अनुसंधान का तेजी से विकास और विकास नवाचार और रचनात्मकता पर निर्भर है वैज्ञानिकों और एक मूल आणविक तकनीक में क्षमता को देखने और नए पर लागू करने की उनकी क्षमता प्रक्रियाओं। पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन का आगमन (पीसीआर) ने आनुवंशिक अनुसंधान में कई दरवाजे खोले, जिनमें से एक साधन भी शामिल है डीएनए विश्लेषण और उनके डीएनए अनुक्रमों के आधार पर विभिन्न जीनों की पहचान। डीएनए अनुक्रमण भी हमारी उपयोग करने की क्षमता पर निर्भर है जेल वैद्युतकणसंचलन डीएनए के स्ट्रैंड्स को अलग करने के लिए जो एक बेस पेयर के समान आकार में भिन्न होते हैं।

1970 के दशक के उत्तरार्ध में, लंबे समय तक डीएनए अणुओं के लिए दो डीएनए अनुक्रमण तकनीकों का आविष्कार किया गया था: सेंगर (या डिडॉक्सी) विधि और मैक्सम-गिल्बर्ट (रासायनिक दरार) विधि। मैक्सम-गिल्बर्ट विधि न्यूक्लियोटाइड- रसायनों द्वारा विशिष्ट दरार पर आधारित है और इसका उपयोग ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स (लघु न्यूक्लियोटाइड पॉलिमर, आमतौर पर लंबाई में 50 बेस-जोड़े से छोटे) के अनुक्रम के लिए किया जाता है। सेंगर विधि का आमतौर पर अधिक उपयोग किया जाता है क्योंकि यह तकनीकी रूप से लागू करने के लिए आसान साबित हुआ है, और, के साथ पीसीआर और तकनीक के स्वचालन के आगमन को आसानी से कुछ पूरे सहित डीएनए के लंबे किस्में पर लागू किया जाता है जीन। यह तकनीक पीसीआर बढ़ाव प्रतिक्रियाओं के दौरान dideoxynucleotides द्वारा श्रृंखला समाप्ति पर आधारित है।

सेंगर विधि में, विश्लेषण किए जाने वाले डीएनए स्ट्रैंड को टेम्पलेट के रूप में और डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग, पीसीआर प्रतिक्रिया में, प्राइमर का उपयोग करके पूरक किस्में उत्पन्न करने के लिए किया जाता है। चार अलग-अलग पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार किए जाते हैं, जिनमें से प्रत्येक में चार न्यूक्लियोटाइड्स (एटीपी, सीटीपी, जीटीपी या टीटीपी) में से एक का एक निश्चित प्रतिशत डायोडॉक्सिन्यूक्लियोसाइड ट्राइफॉस्फेट (ddNTP) एनालॉग होता है।

नए डीएनए स्ट्रैंड का संश्लेषण तब तक जारी रहता है जब तक कि इनमें से किसी एक एनालॉग को शामिल नहीं किया जाता है, जिस समय स्ट्रैंड समय से पहले छोटा हो जाता है। प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया डीएनए स्ट्रैंड की अलग-अलग लंबाई के मिश्रण से युक्त होगी, सभी उस न्यूक्लियोटाइड के साथ समाप्त हो रहे हैं जो उस प्रतिक्रिया के लिए डिडॉक्सी लेबल था। जेल वैद्युतकणसंचलन फिर चार अलग-अलग गलियों में चार प्रतिक्रियाओं के स्ट्रैंड को अलग करने के लिए उपयोग किया जाता है, और स्ट्रैंड्स की लंबाई क्या न्यूक्लियोटाइड के साथ समाप्त होती है, के आधार पर मूल टेम्पलेट के अनुक्रम को निर्धारित करते हैं।

स्वचालित सेंगर प्रतिक्रिया में, प्राइमरों का उपयोग किया जाता है जो चार अलग-अलग रंगीन फ्लोरोसेंट टैग के साथ लेबल किए जाते हैं। पीसीआर प्रतिक्रियाओं, विभिन्न डिडॉक्सिन्यूक्लियोटाइड्स की उपस्थिति में, ऊपर वर्णित के रूप में किया जाता है। हालांकि, अगले, चार प्रतिक्रिया मिश्रण फिर संयुक्त होते हैं और एक जेल के एक लेन पर लागू होते हैं। प्रत्येक टुकड़े का रंग एक लेजर बीम का उपयोग करके पता लगाया जाता है और जानकारी एक कंप्यूटर द्वारा एकत्र की जाती है जो प्रत्येक रंग के लिए चोटियों को दिखाने वाले क्रोमैटोग्राम उत्पन्न करता है, जिसमें से टेम्पलेट डीएनए अनुक्रम हो सकता है निर्धारित।

आमतौर पर, स्वचालित अनुक्रमण विधि केवल लंबाई में लगभग 700-800 बेस-जोड़े के दृश्यों के लिए सटीक होती है। हालांकि, बड़े जीनों का पूर्ण अनुक्रम प्राप्त करना संभव है और, वास्तव में, पूरे जीनोम, प्राइमर वॉकिंग और शॉटगन अनुक्रमण जैसी चरण-वार विधियों का उपयोग करके।

प्राइमर वॉकिंग में, एक बड़े जीन के एक कार्यशील हिस्से को सेंगर विधि का उपयोग करके अनुक्रमित किया जाता है। नए प्राइमरों को अनुक्रम के एक विश्वसनीय खंड से उत्पन्न किया जाता है और इसका उपयोग जीन के उस हिस्से को क्रमबद्ध करने के लिए किया जाता है जो मूल प्रतिक्रियाओं की सीमा से बाहर था।

शॉटगन सीक्वेंसिंग ब्याज के डीएनए सेगमेंट को बेतरतीब ढंग से काटने को अधिक उपयुक्त बनाता है (प्रबंधनीय) आकार के टुकड़े, प्रत्येक टुकड़े का अनुक्रमण, और अतिव्यापी के आधार पर टुकड़ों की व्यवस्था दृश्यों। अतिव्यापी टुकड़ों की व्यवस्था के लिए कंप्यूटर सॉफ्टवेयर के अनुप्रयोग द्वारा इस तकनीक को आसान बना दिया गया है।